Жураковский И.П., Битхаева М.В., Архипов С.А., Пустоветова М.Г., Кунц Т.А., Маринкин И.О.

ЗАВИСИМОСТЬ ЭКСПРЕССИИ БЕЛКОВ СЕМЕЙСТВА BCL-2 В ПЕЧЕНИ КРЫС ОТ УРОВНЯ ЦИТОКИНОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ПРИ ПЕРСИСТЕНЦИИ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ИНФЕКЦИИ

Центральная научно-исследовательская лаборатория ГБОУ ВПО НГМУ

 

It was revealed that Bcl-2 (Bcl-2, Bad) protein family expression in Wistar rat liver depends on cytokines (IL-1β, IL-1β RA, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17, IL-18, TNF-a, INF-g) level in blood serum of persisting bacterial infection caused by Staphylococcus aureus (strain 209).

Key words: bacterial infection, Staphylococcus aureus, apoptosis markers, Bcl-2, Bad, cytokines.

Выявлена зависимость экспрессии белков семейства Bcl-2 (Bcl-2, Bad) в печени крыс Wistar от уровня цитокинов (IL-1β, IL-1β RA, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17, IL-18, TNF-a, INF-g) в сыворотке крови при персистенции бактериальной инфекции, вызванной Золотистым стафилококком (штамм 209).

Ключевые слова: бактериальная инфекция, Золотистый стафилококк, маркеры апоптоза, Bcl-2, Bad, цитокины.

Длительное существование фокальной персистирующей инфекции вызывает определенное изменение функционирования основных гомеостатических систем, и, как следствие, структурную перестройку органов и тканей. Описан синдром сочетанных дистрофически-дегенеративных изменений мезенхимальных производных при локальном хроническом воспалительном процессе, основным составляющим которого является реакция соединительной ткани [1;2].

Принимая во внимание, что печень является не только одним из главных детоксикационных центров, но и обеспечивает защитные функции организма с помощью резидентных макрофагов и клеточной кооперации, велика вероятность вовлечения ее в патогенетические механизмы хронического воспалительного процесса, вызванного персистенцией бактериальной инфекции.

Обращает на себя внимание тот факт, что при рассмотрении вопроса о развитии сопутствующих изменений в печени при инфекционном процессе, исследования сконцентрированы на изучении острых патологических состояний, в частности на сепсисе и септическом шоке [3-6]. Минорные формы взаимодействия макро- и микроорганизмов, при которых печеночная ткань вовлекается в патологический процесс, остаются нераскрытыми.

Наряду с известными многоступенчатыми и многофакторными сторонами иммунного ответа на инфекционный агент особое значение имеет кооперация иммунокомпетентных клеток, опосредованная цитокинами. В настоящее время «цитокиновая сеть» в качестве важного эндогенного механизма иммунорегуляции активно изучается. Определение профиля цитокинов можно рассматривать как важнейшую характеристику иммунной системы, позволяющую глубже понять механизм патогенеза многих заболеваний.

Целью настоящего исследования являлось выявление зависимости экспрессии белков семейства Bcl-2 в печени крыс Wistar от уровня цитокинов в сыворотке крови при персистенции бактериальной инфекции.

Нами проведена оценка экспрессии белков регуляторов апоптоза (Bcl-2, Bad) в печени, а также уровня цитокинов (IL-1β, IL-1β RA, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17, IL-18, TNF-a, INFg) в сыворотке крови 12 самцов крыс Вистар при воспроизведении у них фокальной персистирующей инфекции с помощью Золотистого стафилококка (штамм 209). Животных выводили из эксперимента через 2 и 3 месяца с момента инфицирования. В качестве контроля использовали 6 интактных животных. Количественный анализ площади, на которой выявлялась экспрессия маркеров, проводилась с помощью морфометрического комплекса на базе микроскопа Micros MC 300A, цифровой камеры CX 13c фирмы Baumer и программного обеспечения ImageJ 1.42g. Определяли площадь, занимаемую клеточными элементами экспрессирующих изучаемые маркеры, среднее серое значение яркости площади, занимаемой клеточными элементами экспрессирующих изучаемые маркеры. На основании этих данных вычислялась экспрессия маркера, равная произведению площади, занимаемой клеточными элементами, экспрессирующих маркер, на разность интенсивности окрашивания клеточных элементов, экспрессирующих маркер, и интенсивности окрашивания фона. Исследование цитокинового профиля проводилось наборами реагентов для иммуноферментного определения концентрации (IL-1β, IL-1β RA, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17, IL-18, TNF-a, INF-g) в сыворотке крови - производства  ЗАО «Вектор Бест» (говосибирск) с использованием Wellwasf 4 Mk2 фирмы Thermo scientific (Finland) 2010 г. выпуска и спектрофотометра Multiscan Spectrum фирмы Thermo scientific (Finland) 2010 г. выпуска.

Через 2 месяца после воспроизведения очага хронической инфекции при иммуногистохимическом выявлении в клетках печени белка Bcl-2 не было отмечено статистически значимых изменений от уровня контрольных значений площади, занимаемой клеточными элементами печени с экспрессией этого белка. Однако, интенсивность специфического окрашивания в гепатоцитах была выше, чем в контрольной группе.

Изучение препаратов, на которых выявлялся проапоптотический белок Bad позволило выявить статистически значимое (в 1,6 раза) увеличение площади, занимаемой клеточными элементами с его экспрессией. Кроме того, в печени животных этой группы отмечалось увеличение интенсивности специфического окрашивания гепатоцитов.

Изучение профиля цитокинов позволило выявить статистически значимое повышение провоспалительных (IL-1β, IL-6, INF-g) и противовоспалительных (IL-1β RA, IL-10, IL-17) компонентов иммунной защиты. При поведении корреляционного анализа были получены результаты, указывающие на существование высоко значимых отрицательных зависимостей, во-первых, между концентрацией IL-10 в сыворотке крови животных этой группы и экспрессией маркера Bcl-2 в клетках печени, а также между концентрацией INF-g и уровнем экспрессии Bad.

При оценке через 3 месяца после воспроизведения очага хронической инфекции препаратов с иммуногистохимической окраской на Bcl-2, отмечено уменьшение площади, занимаемой клеточными элементами печени с экспрессией этого белка в 1,7 раза. Вместе с тем наблюдалось увеличение интенсивности специфического окрашивания в гепатоцитах.

Изучение препаратов, на которых выявлялся проапоптотический белок Bad, позволило выявить увеличение площади, занимаемой клеточными элементами с его экспрессией. Кроме того, в печени животных этой группы отмечалось увеличение интенсивности специфического окрашивания гепатоцитов.

Изучение профиля цитокинов позволило выявить статистически значимое повышение провоспалительных (IL-18, INF-g) и противовоспалительных (IL-1β RA, IL-10, IL-17) компонентов иммунной защиты. При поведении корреляционного анализа были получены результаты, указывающие на существование высоко значимых положительных зависимостей, во-первых, между концентрацией IL-2 в сыворотке крови животных этой группы и показателями, характеризующими площадь, занимаемую гепатоцитами со специфической окраской к маркеру Bcl-2 и уровень экспрессии этого маркера в клетках печени. Во-вторых, между площадью, занимаемой гепатоцитами со специфической окраской к маркеру Bad и концентрацией IL-18 в сыворотке крови крыс через 3 месяца после инфицирования животных.

Таким образом, полученные данные, могут свидетельствовать, с одной стороны, о том, что члены семейства белков Bcl-2 непрерывно взаимодействуют друг с другом, находясь в динамическом равновесии между гомо- и гетеродимерами, что может служить причиной высвобождения митохондриальных факторов с активацией в конечном итоге каспазы-9, и развития апоптотических изменений клеточных элементов печени. С другой стороны о зависимости этих процессов от уровня «цитокиновой среды», представляющей собой матрицу взаимодействующих и часто меняющихся сигналов, носящих сложный характер из-за большого разнообразия цитокиновых рецепторов и из-за того, что каждый цитокин может активировать или подавлять несколько процессов, включая свой собственный синтез и синтез других цитокинов.

 

1.       Команденко Н.И., Жураковский И.П., Рыжов А.И. Синдром сочетанных дистрофически-дегенеративных изменений в производных мезенхимы при воздействии фокальной персистирующей инфекции. Свидетельство об интеллектуальной собственности, зарегистрированное ВНТИЦ 07.08.2002г. №72200200029.

2.       Команденко Н.И., Рыжов А.И., Жураковский И.П. Остеохондроз позвоночника: Монография.- Новосибирск: Сибмедиздат НГМУ, 2006.- 246с.

3.       Kanai S, Honda T, Uehara T, Matsumoto T. Liver function tests in patients with bacteremia. J Clin Lab Anal 2008; 22: 66-69 

4.       Ding Y, Zhao L, Mei H, Huang ZH, Zhang SL. Alterations of biliary biochemical constituents and cytokines in infantile hepatitis syndrome. World J Gastroenterol 2006; 12: 7038-7041

5.       Narita R, Murata M, Kihara Y, Abe S, Tabaru A, Yoshikawa I, Otsuki M. Sepsis presenting with severe jaundice. Am J Gastroenterol 2001; 96: 3214-3215

6.       Fang MH, Ginsberg AL, Dobbins WO 3rd. Marked elevation in serum alkaline phosphatase activity as a manifestation of systemic infection. Gastroenterology 1980; 78: 592-597